科技|包包曲及製曲環境中可培養黴菌的分離與鑒定

大曲作為(wei) 一種多酶多菌的微生態製品，在傳(chuan) 統固態發酵白酒釀造過程中主要起提供菌源、糖化發酵、投糧作用和生香作用，又可稱之為(wei) 白酒發酵的原動力。大曲的微生物主要包括黴菌、酵母菌、細菌、放線菌等四大類，其中黴菌是很重要的一類，其複雜而豐(feng) 富的種類和數量賦予了大曲糖化、液化、蛋白分解等各種水解能力及酯化能力。

　　五糧液包包曲是以其獨特的外形而命名，這種形狀獨特的包包曲造型使它接觸空氣的表麵積比一般大曲大，更有利於(yu) 生產(chan) 過程中自然有益微生物的繁殖、代謝，特別是黴菌微生物。包包曲作為(wei) 五糧液釀造過程中的糖化發酵劑，在不同溫度下形成不同的菌係、酶係，有利於(yu) 酯化、生香和香味物質的積累。

　　多年來，關(guan) 於(yu) 大曲中黴菌的研究主要是利用傳(chuan) 統的形態和生理生化等經典微生物學技術結合現代分子生物學技術進行黴菌的分類、優(you) 勢菌及功能性黴菌的分離鑒定等，有效地詮釋了大曲中黴菌的多樣性，為(wei) 白酒的個(ge) 性化和品質提升提供了理論依據。如張霞等采用18SrRNA序列分析結合傳(chuan) 統分離鑒定法從(cong) 貴州某知名酒廠的大曲中分離出歸屬於(yu) 5個(ge) 屬即曲黴屬（Aspergillus）、犁頭黴屬（Absidia）、假埃希氏菌屬（Pseudallescheria）、莖點黴屬（Phoma）、擬青黴屬（Paecilomyces）等104株絲(si) 狀黴菌，並確定MJ-10為(wei) 煙曲黴（Aspergillusfumigatus），MJ-11為(wei) 傘(san) 枝犁頭黴（Absidiacorymbifera）。蘇暢等通過ITS4/5rRNA區序列進行分析比對，分離鑒定出紅曲(Aspergillusruber)、米根黴(Rhizopusoryzae)、微小根毛黴(Rhizomucorpusillus)、煙曲黴(Aspergillusfumigatus)、嗜熱子囊菌(Thermomyceslanuginosus)、謝瓦氏曲黴(Aspergillussalwaensis)、米曲黴(Aspergillusoryzae)等13個(ge) 種屬黴菌。方程等通過高通量測序結合純培養(yang) 的方法從(cong) 高溫大曲中分離得到50株絲(si) 狀真菌，分別隸屬於(yu) Aspergillus、Monascus、Byssochlamys、Lichtheimia、Rhizomucor、Mucor、Arthrinium、Alternaria、Thermomyces和Rasamsonia等10個(ge) 屬，並標明這些絲(si) 狀真菌具有強大的次級代謝產(chan) 物合成潛力。

　　本研究采用傳(chuan) 統的形態學和分子生物學的鑒定手段對五糧液包包曲中主要黴菌進行分離和鑒定，以此初步探討包包曲中黴菌的組成和係統發育情況，為(wei) 保護包包曲中豐(feng) 富的黴菌資源打下堅實基礎。

材料與(yu) 方法

　　

　　1.1 材料、試劑及儀(yi) 器

　　1.1.1樣品來源

　　包包曲取自宜賓五糧液股份有限公司製曲車間，對曲房環境微生物及生產(chan) 過程中0d、3d、5d、9d、30d的包包曲進行采集。

　　1.1.2培養(yang) 基

　　馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yang) 基、察氏瓊脂（CDA）培養(yang) 基、孟加拉紅培養(yang) 基。

　　1.1.3儀(yi) 器設備

　　電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械公司；生化培養(yang) 箱(LRH)，上海一恒科技儀(yi) 器有限公司；電子天平(AL204)，梅特勒-托利多儀(yi) 器上海有限公司。

　　1.2黴菌的分離與(yu) 鑒定

　　1.2.1分離純化

　　將包包曲磨碎混勻後取10g加入到90mL無菌生理鹽水中充分振蕩混勻後，取上清菌懸液1mL到裝有9mL無菌水的試管中，采用10倍梯度稀釋塗布法進行分離，選取10-3、10-4、10-5、10-64個(ge) 梯度(原載於(yu) 中國白酒雜誌第202002期)塗布平板，28℃培養(yang) 箱中培養(yang) 3d，挑取明顯特征不同的單菌落進行劃線純化分離，然後將其接種於(yu) 試管斜麵，置於(yu) 4℃保藏備用。

　　曲房環境微生物的采集方法：將製備好的平板置於(yu) 房間四個(ge) 角落位置，每個(ge) 位置放置3個(ge) 平板。打開平板蓋，放置5min，利用空氣沉降法收集微生物，然後蓋上平板蓋，置於(yu) 28℃培養(yang) 箱中培養(yang) 3d，挑取明顯特征不同的單菌落進行劃線純化分離，然後將其接種於(yu) 試管斜麵，置於(yu) 4℃保藏備用。

　　1.2.2菌株鑒定和歸類

　　1.2.2.1菌株形態學鑒定

　　按照《微生物學實驗手冊(ce) 》和《真菌鑒定手冊(ce) 》等將所有分離到的菌株進行初步分類。然後使用乳酸石碳酸棉蘭(lan) 染色液染色，鏡檢，記錄觀察目的菌株的形態特征。

　　1.2.2.2菌株分子生物學鑒定

　　DNA提取：取純菌的菌體(ti) 富集液5000r/min離心10min，棄上清液，收集菌體(ti) ，采用SK8259（真菌）試劑盒操作進行黴菌基因組DNA的提取。

　　PCR擴增：采用真菌通用引物為(wei) NS1（5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'）和NS8（5'-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3'），PCR反應體(ti) 係包括0.5μL的基因組DNA、2.5μL的5×Buffer（含Mg2+）、1μL的dNTP、0.2μL的聚合酶、0.5μL的引物、0.5μL模板，加雙蒸水至25μL，PCR循環條件為(wei) 95℃、3min預變性、94℃、30s變性、55℃、25s退火、72℃、1min延伸、循環35次，72℃、5min修複延伸，4℃終止反應。經PCR反應擴增出18SrRNA產(chan) 物，用PCR及酶反應產(chan) 物純化試劑盒將PCR產(chan) 物進行純化，將純化產(chan) 物交由上海生工生物工程股份有限公司完成測序的後續工作。

　　　1.3 黴菌的係統發育分析

　　依據參考文獻，將測得的18SrRNA序列在NCBI中進行BLAST比對，得到的同源序列和測定序列在ClustalX軟件包中進行分析，形成一個(ge) 多重序列匹配排列陣導入MEGA5.0軟件，采用鄰位相連（Neighbor-Jioning）法構建係統發育樹。 

結果和分析

　　

　　2.1 包包曲中可培養(yang) 黴菌的分離

　　采用稀釋平板法從(cong) 包包曲培養(yang) 過程的曲樣中分離純化得到18株黴菌，依據其孢子結構、菌落形態與(yu) 顏色等將18株菌初步鑒定為(wei) A—I9大類群。

　　黴菌的形態學鑒定包括黴菌的菌落特征和菌體(ti) 孢子形態結構。初步歸類的9大類群的菌體(ti) 具體(ti) 菌落特征及孢子形態特征如圖1所示。

圖1代表性黴菌的菌落結構圖

　　注：左邊：菌落培養(yang) 狀態；右邊：分生孢子梗及分生孢子。

　　18株黴菌經初步歸類為(wei) 9大類群的具體(ti) 形態特征描述如表1所示。

表1包包曲中分離到的黴菌

　　2.2 18SrRNA的PCR產(chan) 物純化結果

　　由圖2可知，已分離黴菌的18SrRNA的分子大小基本上都在1300bp左右且亮度較高,說明擴增的片段與(yu) 引物對的理論長度基本一致，且產(chan) 物濃度適合後續測序。

　　圖2包包曲中部分黴菌18SrRNA的PCR純化片段電泳圖

　　注：MK為(wei) RNAmarkerDL10000片段長度標記；A—I依次為(wei) 9大類群的部分代表菌株。

　　2.3包包曲中黴菌物種的18SrRNA分子鑒定

　　本研究選取不同時期包包曲樣本來研究包包曲中可培養(yang) 黴菌的物種多樣性。根據不同類型的黴菌對其生長繁殖時需求的營養(yang) 物質可能不同，本研究采用3種不同類型的培養(yang) 基進行篩選和分離，其目的就是盡可能多的獲得黴菌物種。在篩選過程中，對於(yu) 具有相似形態和生長特征的黴菌，僅(jin) 保留1株。最後共篩選分離得到19株黴菌。進一步根據形態和培養(yang) 特征，選取A類群菌株4株，B類群菌株3株，C、D、E、G、H類群菌株各1株，F類群菌株2株，I類群菌株4株共計18株。菌株的18SrRNA序(原載於(yu) 中國白酒雜誌第202002期)列在NCBI中用BLAST進行同源性分析，結果發現用傳(chuan) 統的菌株鑒定方法可鑒定出有差異的菌株，這9個(ge) 類群又歸為(wei) 9個(ge) 大類群，其同源性分析結果見表2。各類群（代表菌株）編號分別為(wei) A（A1、A2）、B（B1、B2）、C、D、E、F、G、H（H1、H2）、I。

表2各類群代表菌株18SrRNA的同源性分析結果

　　從(cong) 表2可以看出，19株分離菌株大部分與(yu) 已報道的菌株具有99%以上的相似度，表明這些已分離菌株都已經在NCBI中找到相似度非常高的菌株。不僅(jin) 如此，B1菌株與(yu) 米曲黴（Aspergillusoryzae）的相似度達到了100%，G1菌株與(yu) 單孢根黴菌（Rhizopusazygosporus）的相似度達到了100%，說明菌株B1和菌株G1已經鑒定到了種。

　　2.4包包曲中黴菌物種的係統發育樹分析

　　這9個(ge) 類群中每一類群代表菌株的18SrRNA序列和用BLAST檢索到的與(yu) 之有高度同源性菌株的18SrRNA序列，通過ClustalX軟件和MEGA5.0軟件構建N-J係統發育樹，結果見圖3。可通過係統發育樹的建立對包包曲中分離出的不同類型的黴菌的種間親(qin) 緣關(guan) 係進行了直觀界定。

　圖3基於(yu) 18SrRNA全序列為(wei) 基礎的包包曲中黴菌的係統發育樹

　　在圖3的係統發育樹中，包包曲分離得到的黴菌菌株的類別較為(wei) 豐(feng) 富，分別為(wei) 青黴屬（Penicillium）、曲黴屬（Aspergillus）、絲(si) 衣黴菌屬（Byssochlamys）、橫梗黴屬（Lichtheimia）、毛黴屬（Mucor）、尖鐮孢菌屬（Fusariumoxysporum）、刺孢小克銀漢黴（Cunninghamellaechinulata）、根黴屬（Rhizopus）和Microstroma等9個(ge) 已知黴菌屬，它們(men) 相互之間的親(qin) 緣關(guan) 係較遠，表明包包曲中的黴菌有著很高的遺傳(chuan) 多樣性和種屬多樣性。

　　其中A1、A2等4株菌株聚為(wei) 一支，且與(yu) 灰黃青黴（Penicilliumgriseofulvum）、斜臥青黴（Penicilliumdecumbens）遺傳(chuan) 關(guan) 係較近。B1、B2等3株菌株聚為(wei) 一支，且分別與(yu) 溜曲黴（Aspergillustamarii）、米曲黴（Aspergillusoryzae）、土曲黴（Aspergillusterreus）聚在一起。(原載於(yu) 中國白酒雜誌第202002期)H1、H2等5株菌株聚為(wei) 一支，分別與(yu) 傘(san) 狀橫梗黴（Lichtheimiacorymbifera）、分枝橫梗黴（Lichtheimiaramosa）遺傳(chuan) 關(guan) 係相近。菌株C、D、E、F、G、I分別與(yu) 絲(si) 衣黴屬（Byssochlamy.sp）、尖鐮孢菌（Fusariumoxysporum.f.sp.cucmrium）、白地黴（Galactomycescandidum）、刺孢小克銀漢黴（Cunninghamellaechinulata）、小單孢根黴菌（Rhizopusmicrosporus）、卷枝毛黴（Mucorcircinelloides）和Microstromaphylloplanum各單獨聚為(wei) 一支。

　　基於(yu) 以上結果說明，基於(yu) 可培養(yang) 的方法在目前微生物群落研究中仍然發揮著不可替代的作用。

結 論

　

　　五糧液和瀘州老窖作為(wei) 濃香型白酒的典型代表，釀造生產(chan) 均是大曲。五糧液釀造生產(chan) 用曲為(wei) 包包曲，屬於(yu) 中溫偏高溫曲，是以純小麥為(wei) 原料，生料製曲，自然接種，皮薄心厚，濃香純正，發酵周期短，頂溫中溫偏高溫，最高溫可達63℃；而瀘州老窖釀造生產(chan) 用曲為(wei) 中高溫大曲，是以純小麥和高粱為(wei) 原料，製曲最高溫達到65℃。原料與(yu) 溫度等不同造就大曲中微生物種類存在較大差異。研究者們(men) 針對不同區域的中(原載於(yu) 中國白酒雜誌第202002期)高溫大曲的微生物群落結構研究表明，黴菌尤其是根黴是曲塊側(ce) 麵和曲包表層的優(you) 勢類群，曲心的優(you) 勢菌群主要是芽孢杆菌，曲塊底麵主要是青黴和犁頭黴，而黃曲黴、紅曲黴在曲塊各部位均存在。王彩虹等采用ITS基因文庫法分析得到瀘州老窖中高溫大曲的優(you) 勢黴菌群落為(wei) 掃帚狀曲黴、米根黴、微小根毛黴等曲黴屬和根黴屬。姚萬(wan) 春等從(cong) 瀘州老窖國窖曲中分離的黴菌有根黴、毛黴、梨頭黴、黃曲黴、青黴和紅曲黴等6類黴菌。本次研究的包包曲分離鑒定出刺孢小克銀漢黴、尖鐮孢菌屬、絲(si) 衣黴菌屬和Microstroma屬等種類，極大地豐(feng) 富了中高溫大曲中黴菌屬種類。

　　大曲中糖化酶和液化酶活力的高低與(yu) 大曲中微生物尤其是黴菌的生長繁殖有關(guan) ，而糖化力和酯液化力是衡量大曲質量好壞的重要指標。趙東(dong) 等揭示了五糧液包包曲發酵過程中微生物區係的變化與(yu) 其理化因子在演變過程中的關(guan) 係，為(wei) 提高包包曲質量提供理論依據。故係統全麵研究大曲中優(you) 勢黴菌種類有助於(yu) 提高大曲質量，進而提高出酒率。

　　本研究中，采用了PDA培養(yang) 基、CDA培養(yang) 基、孟加拉紅培養(yang) 基3種培養(yang) 基對五糧液包包曲中的黴菌微生物進行稀釋分離，並對獲得的純培養(yang) 菌種進行了分子生物學鑒定與(yu) 係統發育學分析。研究結果表明，濃香型包包曲內(nei) 存在大量青黴屬、曲黴屬、毛黴屬、根黴屬、橫梗黴屬、刺孢小克銀漢黴、尖鐮孢菌屬、絲(si) 衣黴菌屬等主要黴菌類群，極大的豐(feng) 富了對濃香型包包曲中黴菌菌株的認識。此外采用18SrRNA全序列進行黴菌的分子鑒定可將大多數的黴菌鑒定到屬。（完）